呼吸是维持所有动物身体机能的重要组成部分。因此，当氧气稳定状态被破坏时，身体往往会通过调整呼吸参数来做出反应。然而，在斑马鱼胚胎或幼鱼等小型生物中，客观地测量呼吸运动已被证明是困难的。
本文将探讨海德堡大学的研究人员对我们的产品斑马鱼微视行为分析系统的新颖应用。Nadine Kämmer和她的同事使用斑马鱼微视行为分析系统客观地测量斑马鱼的呼吸运动，并将这种方法与手动评估进行了比较[1]。

为什么不手动测量呼吸？
维持氧气稳态非常重要，因为氧气是通过产生有氧能量以维持细胞代谢所必需的。当暴露在低氧环境（缺氧）中时，鱼类往往会增加呼吸动作，以增强氧气提取。相反，当暴露在高氧环境（高氧）中时，他们会通过减少呼吸来节省能量，这也可以防止过量的氧气摄入，从而防止氧化应激。然而，这种呼吸频率降低的潜在负面影响是血液中二氧化碳的积聚，导致酸中毒。
由此我们可以得出，呼吸是鱼类对环境生理反应的良好指标。然而，手动计算斑马鱼的呼吸既耗时，又不可靠。可靠性问题在一定程度上使人工计数在现代科学时代变得不可行。


缺乏良好的客观方法
虽然客观的衡量标准确实存在，但对于大多数研究来说，它们并不是最佳的。将电极连接到鳃盖（为鳃提供结构支撑和保护的骨骼）进行了研究。然而，这种方法非常具有侵入性，只适用于较大的鱼类，而不适用于胚胎和幼鱼。
电极也以非侵入性的方式被用于检测由生物电信号介导的水电导率的变化。然而，由于鱼胚胎的大小，它们的身体运动会干扰呼吸运动的检测，因此不适合对鱼胚胎进行研究。

每一次呼吸，都会测量
Nadine Kämmer和她的同事着手解决这个问题。为了比较斑马鱼不同生命阶段的呼吸运动和反应，对4天大的斑马鱼胚胎和12天大的幼鱼进行了测量。鱼类短期暴露于（1小时）水中不同浓度的lindane（引起呼吸压力的神经毒性农药）、溶剂对照组中。
视频记录是在鱼胚胎被麻醉的同时进行的，以防止身体运动干扰测量。将鱼转移到凝胶袋中后，对其进行2分钟的驯化，然后在显微镜下以每秒25帧的帧速率对鱼进行视频跟踪。
这些视频随后被用于手动计数以及斑马鱼微视行为分析系统中的分析。人工计数是由两名观察者通过观察鱼的嘴或盖来完成的。在这里，一口气被定义为其中一个身体部位的运动（取决于鱼的方向）。


斑马鱼微视行为分析系统的新颖应用
为了便于客观测量，使用了Noldus的斑马鱼微视行为分析系统。最初，斑马鱼微视行为分析系统被设计用于自动检测早期斑马鱼的活动。它可以测量许多参数，如：爆发活动/持续时间、不活动，但也可以测量更具体的生理参数，如尾巴卷曲和血液/肠道流量。
由于斑马鱼微视行为分析系统没有内置的呼吸检测功能，研究人员必须进行一些前处理和后处理步骤。总之，他们导入的视频帧速率必须保持不变，因为斑马鱼微视行为分析系统无法处理不规则的帧速。然后，必须在程序中绘制感兴趣的区域，然后为本研究优化检测设置。关于Kämmer等人采取的确切步骤，请参阅他们的文章。


接下来该如何做？
一般来说，斑马鱼微视行为分析系统的测量显示，与手动计数相比，压力鱼的呼吸频率要高得多。这可能意味着手动计数可能会错过呼吸动作的情况，尤其是在lindane浓度较高的情况下，当呼吸频率急剧增加，动作变得快速和不规则时。此外，在这些情况下，人工计数低估了呼吸频率高达250%。
有了斑马鱼微视行为分析系统的这一新应用，研究人员能够成功测量斑马鱼幼鱼和胚胎的呼吸频率和振幅。这些客观的测量方法在斑马鱼研究中，特别是在毒理学和药理学方面非常有价值。它使研究人员能够看到某些物质和药物在不同生命阶段的影响，而这在以前是不可能的。
Kämmer等人最后表示，虽然使用斑马鱼微视行为分析系统进行这一分析需要一些步骤，但这是一个值得进一步研究和验证的有趣课题。此外，手动设置感兴趣区域也可用于检测斑马鱼的其他小动作，如眼球运动或塑料颗粒通过肠道或鳃。


参考文献
1. Kämmer, N.; Reimann, T.; Ovcharova, V.; Braunbeck, T. A Novel Automated Method for the Simultaneous Detection of Breathing Frequency and Amplitude in Zebrafish (Danio Rerio) Embryos and Larvae. Aquat. Toxicol. 2023, 258, 106493.


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